DNA的得率問(wèn)題排在MOBIO收到的技術(shù)咨詢(xún)前五位。沉積物、棉拭子、廢水活性污泥等我們都聽(tīng)說(shuō)過(guò)未能提取到足夠DNA。畢竟DNA沒(méi)人會(huì)嫌多。

當(dāng)有人告訴我們他們沒(méi)能獲得足夠DNA的時(shí)候，我們首先排除一些常見(jiàn)的錯(cuò)誤。比如因未能理解某個(gè)操作步驟而做錯(cuò)了，或者選擇了一個(gè)不合適的試劑盒。也有可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室同事留給你的樣品在室溫下過(guò)夜卻沒(méi)有告訴你，諸如此類(lèi)的原因可以列出很多很多。然而，真正的原因有可能很簡(jiǎn)單，因?yàn)镈NA得率低（這里說(shuō)的低得率指的是低于用分光光度計(jì)，比如Nanodrop，檢測(cè)下限的濃度濃度）并不一定意味著操作過(guò)程出了錯(cuò)，有可能一開(kāi)始樣品中就沒(méi)有多少核酸，這種情況在棉拭子、濾膜和沉積物等生物含量較少的樣品中很常見(jiàn)。

當(dāng)你著手研究一個(gè)從未做過(guò)的樣品，你可能不太知道微生物的類(lèi)型和微生物含量，因此也會(huì)不確定預(yù)期得率能有多少，尤其是野外采集的環(huán)境樣品。例如，每種土壤都有不同的pH、腐植酸含量、含碳量等。幸運(yùn)的是，你并不需要摸黑前進(jìn)，只要做一個(gè)對(duì)照即可。

對(duì)于土壤樣本，最好陽(yáng)性對(duì)照就是加入一定數(shù)量的細(xì)菌或者真菌到樣品中，然后嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)做一次。細(xì)菌或真菌樣品可以自行過(guò)夜孵育制備。最好選擇希望在樣品中找到的代表性微生物。然后取1-2毫升培養(yǎng)物離心收集細(xì)胞。像大腸桿菌，1毫升過(guò)夜培養(yǎng)物大概含有10^9個(gè)細(xì)胞，能提取到約5微克DNA。真菌的細(xì)胞DNA含量大約是細(xì)菌的10倍。查查你實(shí)驗(yàn)對(duì)象的基因組大小，測(cè)量一下培養(yǎng)物的細(xì)胞密度并對(duì)DNA的得率做出預(yù)估。然后，離心培養(yǎng)物收集細(xì)胞沉淀并用少量的中性緩沖液重懸，比如100μl生理鹽水，將重懸液混入土壤樣品中并在開(kāi)始提取前至少孵育10分鐘。與此同時(shí)平行提取你的原始樣品。這樣從標(biāo)準(zhǔn)化的和沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的樣品之間的濃度差就可以判定樣品中含有多少DNA，如果行不通，可能是土壤中含有金屬等雜質(zhì)干擾了樣本處理或者勻化不充分導(dǎo)致細(xì)胞裂解不完全等原因造成的。如果仍然搞不定，請(qǐng)聯(lián)系MO BIO的技術(shù)支持。

其它樣本也可以做類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，按你的標(biāo)準(zhǔn)將純培養(yǎng)物和處理樣本結(jié)合起來(lái)就行，例如，你正在過(guò)濾的池水，可以先用純培養(yǎng)的微生物標(biāo)準(zhǔn)化，再按既定的方法過(guò)濾處理樣本，這樣的話(huà)可以保證DNA提取方法是沒(méi)有問(wèn)題的，測(cè)出樣品的濃度，又消除了一個(gè)未知因素。事實(shí)上，哪怕你對(duì)目前的提取方法已經(jīng)很熟練了，也最好每次實(shí)驗(yàn)都做這樣一個(gè)對(duì)照，這只需在試驗(yàn)前期花費(fèi)很少的時(shí)間，就很可能為你的下游實(shí)驗(yàn)節(jié)省許多工作量。